A DÁFNIA COMO MODELO ANIMAL RELEVANTE PARA A ECOTOXICOLOGIA

A poluição ambiental resultante das numerosas atividades antropogénicas é um problema crescente e global, com impactos negativos tanto nos ecossistemas terrestres como aquáticos, contaminando as águas superficiais mas também as águas subterrâneas (Chae e An, 2018; Brudler et al., 2019). Os tóxicos chegam facilmente aos ecossistemas aquáticos, direta (fontes pontuais) ou indiretamente (fontes difusas), e podem causar uma redução na qualidade ecológica da água afetando os organismos aquáticos, incluindo os invertebrados que se encontram na base da cadeia trófica. Numerosos tipos de contaminantes, incluindo os micropoluentes emergentes estão presentes nas águas superficiais, nos sedimentos ou nos organismos aquáticos, originando uma poluição complexa, causando diversos efeitos tóxicos a curto e a longo prazo tanto para o meio ambiente como para a saúde humana (Ribeiro et al., 2018; Coelho et al., 2019; Sousa et al., 2019).

Deste modo, a gestão e a qualidade da água doce são cada vez mais importantes de maneira a não perturbar a biodiversidade dos ecossistemas fluviais, nem limitar os seus usos para diversas atividades, tais como aquacultura, irrigação na agricultura, abastecimento público, pesca recreativa, entre outros.

Os organismos vivos fornecem respostas reais dos efeitos dos tóxicos, refletindo a sua toxicodinâmica e toxicocinética, dando informações valiosas (como complemento das tradicionais análises físico-químicas) refletindo essa informação na fisiologia, histologia, crescimento, reprodução e em último caso na mortalidade.

Dessa forma, a ecotoxicologia é uma ciência que pretende estudar (em laboratório ou no campo) os efeitos dos poluentes, a sua transformação e transferência ao longo das cadeias tróficas a fim de obter dados sobre a toxicidade dos poluentes e/ou dos seus metabolitos, e os seus efeitos nas espécies de vários níveis tróficos, na dinâmica das populações e nas comunidades. Os ensaios ecotoxicológicos realizados sob condições controladas são importantes para estabelecer uma relação dose-resposta direta dos tóxicos ou das misturas de tóxicos, durante ensaios agudos ou crónicos.

Estes dados permitem também estabelecer valores máximos admissíveis bem como avaliar o risco ou impacto da ocorrência de poluentes nos diversos tipos de ecossistemas. Com base nesta informação as autoridades reguladoras competentes podem implementar diversas medidas de forma a minimizar ou mitigar estes efeitos negativos (Leveque et al., 2013; Ma et al., 2013; Orias e Perrodin, 2013; Yang, 2013; Marzullo et al., 2018; Romano et al., 2019).

Várias abordagens podem ser usadas para avaliar o efeito das substâncias tóxicas ou o seu efeito potencial, incluindo testes in silico, in vitro e in vivo (figura 1).

Os testes in silico são baseados em técnicas computacionais que permitem estimar a toxicidade potencial de moléculas com base na sua estrutura molecular por comparação com outras estruturas moleculares usando vastas bases de dados – área da quimioinformática (Khan et al., 2019).

Os testes in vitro correspondem a estudos realizados em células, tecidos ou órgãos isolados em condições controladas no laboratório, enquanto que os testes in vivo utilizam organismos vivos como algas, protozoários, minhocas, dáfnias, peixes, roedores etc., representando os diferentes níveis de redes tróficas (Heger et al., 2018).

Figura 1. Esquema que mostra as diferentes abordagens de fazer a avaliação dos efeitos ecotoxicológicos potenciais ou reais de compostos químicos. Podem ser utilizadas diferentes metodologias e diferentes organismos: in silico usando técnicas computacionais; in vitro usando culturas de células ou embriões de peixes e técnicas in vivo usando diversos organismos vivos (minhoca, dáfnia, peixe-zebra e roedores).

 

Para proteger os direitos fundamentais dos animais e o seu bem-estar, todos os testes que utilizam animais vertebrados vivos e cefalópodes devem cumprir a legislação relativa à proteção de animais utilizados para fins experimentais e científicos que está em vigor em Portugal (Diretiva da União Europeia 2010/63/UE, transcrita no Decreto-Lei 113/2013).

Isto é, em estudos ecotoxicológicos realizados com vertebrados como os peixes e roedores, é necessário ter a autorização do Órgão Responsável pelo Bem-Estar dos Animais (ORBEA) da respetiva instituição de investigação, mas também da Direção Geral de Alimentos e Veterinária (DGAV).

Os ensaios realizados com invertebrados como a dáfnia (Daphnia sp.), a minhoca (Eisenia sp.) ou a drosófila (Drosophila melanogaster) não estão abrangidos pela legislação de bem-estar animal, devido à sua menor complexidade neurológica e sensorial. No entanto, devem ser seguidos e aplicados os princípios gerais de bioética, e só devem ser realizados os ensaios que sejam estritamente necessários para atingir os objetivos do estudo.

Destes organismos modelo, a dáfnia tem sido muito utilizada como bioindicador em estudos ecotoxicológicos no seu habitat natural (Jansen et al., 2017), devido a ser uma espécie chave na base da cadeia alimentar, ser bastante sensível aos fatores ambientais e atuar indiretamente como uma espécie sentinela (Le et al., 2016).

 

Taxonomia e biologia da espécie

A dáfnia é um microcrustáceo planctónico de água doce, frequentemente chamado de pulga de água, por causa dos seus movimentos irregulares de natação que se assemelham a pulgas ou saltos de pulgas marinhas.

É uma espécie encontrada frequentemente em ecossistemas aquáticos de água doce lêntica e prefere temperaturas entre 18 e 22 °C, no entanto pode suportar temperaturas entre 2 a 28ºC (Vanoverbeke et al., 2007).

Durante o inverno e o início da primavera, a densidade populacional da dáfnia diminui e, com o aumento da temperatura (acima de 12 °C), há um aumento no número de organismos podendo a população atingir densidades de 200 a 500 organismos por litro de água (Castro e Gonçalves, 2007). No entanto, outros fatores como o pH, luz, quantidade de alimento e a presença de xenobióticos influenciam a densidade populacional e também a sua mobilidade (Alekseev e Lajus, 2009).

Estes organismos medem cerca de 5 mm, e são amplamente utilizados em estudos de ecotoxicologia aquática, sendo a Daphnia magna (de Oliveira et al., 2016) e a Daphnia pulex (Taylor et al., 2016) as espécies mais utilizadas nesses ensaios (OECD, 2004).

A dáfnia possui um exoesqueleto transparente composto de quitina que cobre todo o corpo exceto a cabeça, o qual tem a função de proteger e impermeabilizar, impedindo o crescimento de algas e de protozoários (Covich et al., 2010).

Na região posterior da cabeça, a dáfnia possui 2 antenas secundárias que permitem a sua locomoção. Os juvenis e os adultos possuem de cada lado da cabeça, um olho composto, numa posição central com pigmentação escura, o qual contém os omatídios que permitem detetar a luz (Ebert, 2005), e mais abaixo possuem um pequeno olho simples, chamado de ocelo (figura 2).

Figura 2. Esquema da anatomia de uma dáfnia fêmea (Daphnia magna), um microcrustáceo usado em estudos de ecotoxicologia para avaliar o efeito de diversos contaminantes, como pesticidas, medicamentos, poluentes industriais, nanoplásticos, drogas, etc.

 

Na região abdominal encontram-se 4 a 6 pares de filópodes (membros torácicos), que, juntamente com as antenas, têm a função de gerar uma corrente de água permanente que permite por um lado a respiração (devido ao fluxo de água rico em oxigénio) e por outro a alimentação (as partículas alimentares são encaminhadas para a boca). O alimento que chega à boca é então esmagado pelos maxilares e misturado com muco, formando o bolo alimentar (Peñalva-Arana et al., 2007). Na natureza, a dáfnia alimenta-se de partículas de matéria orgânica em suspensão, incluindo bactérias, leveduras e fitoplâncton/microalgas (Lampert, 2006). No pós-abdómen existe uma garra que tem como função limpar os membros torácicos e se necessário retirar o bolo alimentar indesejado.

Na região posterior do abdómem, as fêmeas apresentam uma câmara incubadora, onde os ovos se desenvolvem (Smirnov, 2017a).

 

Ciclo de vida

A dáfnia pode reproduzir-se durante todo o ano, mas o pico ocorre durante o verão (no hemisfério norte). Este microcrustáceo tem a capacidade de realizar a reprodução sexuada ou assexuada (partenogênese cíclica) dependendo das condições externas (Figura 3).

Quando as condições ambientais são adversas as dáfnias reproduzem-se sexuadamente. Nesta caso, as fêmeas produzem inicialmente machos assexuadamente os quais vão posteriormente fertilizar internamente os ovos haploides, o que permite aumentar a variabilidade genética da população (Campos et al., 2018).

Sob condições ambientais favoráveis, as fêmeas reproduzem-se assexuadamente, produzindo ovos diploides (que não precisam de fertilização), originando filhas geneticamente idênticas (clones) através de ovos resistentes (efípios). Este tipo de reprodução é importante em estudos ecotoxicológicos, pois permite obter animais geneticamente semelhantes, no entanto, não reflete o que acontece na natureza (Ebert, 2005).

Figura 3. Esquema do ciclo reprodutivo da dáfnia, fase sexuada e assexuada. A reprodução assexuada ocorre quando as condições ambientais são favoráveis à dáfnia e originam fêmeas geneticamente iguais às progenitoras. A reprodução sexuada ocorre em condições ambientais desfavoráveis para a dáfnia, e há produção de machos e fêmeas (maior variabilidade genética).

 

A duração do ciclo de vida é influenciada por condições ambientais, como a temperatura e a quantidade de alimento disponível. Quando a temperatura é mais alta e a comida é abundante, a fêmea cresce mais e o tempo necessário para atingir a maturidade é menor.

A esperança média de vida da dáfnia é de cerca de 56 a 60 dias com a temperatura ótima de 20 °C. Pode ter uma vida mais curta, cerca de 40 dias quando a temperatura é mais alta, cerca de 25 °C.

O ciclo de vida compreende quatro estágios de desenvolvimento distintos: ovo, juvenil, adolescente e adulto (Jonczyk e Gilron, 2005). Os ovos podem ser partenogénicos ou em diapausa. Os primeiros são produzidos assexuadamente e dão origem a juvenis na câmara de incubação. Os ovos em diapausa são produzidos sexualmente, formando ovos haploides fertilizados que não se desenvolvem, entrando num estado de repouso, chamados de efípio (figura 4) ou “ovos de resistência” (Smirnov, 2017b). Estes ovos estão envolvidos por uma membrana protetora, tornando-os resistentes a condições adversas, tais como a desidratação e o congelamento. Sob condições ambientais favoráveis, os ovos de resistência podem eclodir em novos organismos (Slusarczyk et al., 2019).

Figura 4. Fotografia na qual se pode observar numerosos efípios de D. magna, que são estruturas castanhas com duas manchas redondas mais escuras e que correspondem a dois  “ovos de resistência”.

 

Quando os ovos eclodem dentro da câmara de incubação, nascem os juvenis (morfologicamente idênticos aos adultos) e ao fim de 3 dias são libertados para o exterior. Após a saída dos juvenis, novos ovos são depositados na câmara de incubação (Ebert, 2005).

Após a libertação do exosqueleto (ecdise), os juvenis podem crescer uma vez que a nova carapaça é elástica. Durante a fase juvenil, a dáfnia sofre entre 3 a 5 ecdises até à maturação, sendo esta fase marcada pela primeira postura dos ovos na câmara de incubação (Jonczyk e Gilron, 2005).

A fase adolescente corresponde ao tempo necessário para que ocorra a maturação dos ovos na câmara de incubação, após o qual o organismo entra na fase adulta, entre o 10º e 13º dia de vida.

As fêmeas adultas podem produzir entre 6 a 10 ovos a cada 3 ou 4 dias, os quais eclodem após 1 dia na câmara de incubação se a temperatura for de 20 °C (Campos et al., 2018).

Os machos adultos são menores que as fêmeas adultas e possuem antenas maiores, um pós-abdômen modificado e não possuem câmara de incubação.

 

A dáfnia como modelo animal

A Daphnia sp. é amplamente utilizada como modelo animal (figura 5) em estudos relacionados à ecologia, genética e fisiologia, mas também em estudos de toxicologia aquática e ecotoxicologia, pois apresenta várias vantagens como: grande sensibilidade a poluentes e xenobióticos em geral, facilidade de manuseio e manutenção, boa relevância ecológica, ciclo de vida curto, baixo custo dos ensaios e reprodução assexuada (permite controlar a variabilidade genética de organismos), entre outras (Minguez et al., 2015).

Figura 5. Microfotografia de uma dáfnia adulta fêmea, com cerca de 4 mm de comprimento total (desde o topo da cabeça até ao extremo do espinho caudal – linhas pretas). Nesta imagem podemos observar alguns ovos dentro da câmara de incubação.

Portanto, para a avaliação ecotoxicológica de compostos tóxicos, foram desenvolvidos vários protocolos por várias organizações internacionais, nomeadamente a Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Económico (OCDE) e a Organização Internacional de Padronização (ISO).

Para avaliar os efeitos da toxicidade aguda e crónica, e de maneira a padronizar os ensaios realizados em diferentes laboratórios de diferentes países, a OCDE desenvolveu normas e diretrizes específicas para os diferentes tipos de ensaios e os diferentes modelos animais.

O Teste da OCDE nº 202, é um ensaio agudo que visa avaliar a imobilização da dáfnia. Este protocolo tem como objetivo avaliar a percentagem de organismos não imobilizados versus imobilizados, quando expostos a diferentes concentrações de tóxicos por um curto período de tempo, 24 e 48 horas, por comparação com animais controlo (OECD, 2004).

O Teste da OCDE nº 211, atualizado em 2012, visa avaliar a toxicidade crónica aos 21 dias, usando em geral concentrações 10 vezes mais baixas que as utilizadas nos ensaios agudos, a fim de avaliar os efeitos na reprodução, por comparação com animais controlo (OECD, 2012).

 

Ondina Ribeiro1, Cláudia Ribeiro2,3, Mónica Quelhas Pinto1, Filomena Teles2, Maria Elizabeth Tiritan2,3,4 e João Soares Carrola5*

 

1 Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Apartado 1013, 5000-911 Vila Real, Portugal

2CESPU, Instituto de Investigação e Formação Avançada em Ciências e Tecnologias da Saúde, Rua Central de Gandra, 1317, 4585-116 Gandra PRD, Portugal

3Interdisciplinary Center of Marine and Environmental Research (CIIMAR), University of Porto, Edifício do Terminal de Cruzeiros do Porto de Leixões, Av. General Norton de Matos s/n, 4050-208 Matosinhos, Portugal

4Laboratório de Química Orgânica e Farmacêutica, Departamento de Ciências Químicas, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Rua Jorge de Viterbo Ferreira 228, 4050-313 Porto, Portugal

5 Departamento de Biologia e Ambiente, Centro de Investigação e Tecnologias Agroambientais e Biológicas (CITAB), Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal;  joao@utad.pt

 

(Copyright – todas as imagens, esquemas e fotografias são da autoria de Ondina Ribeiro e João Soares Carrola – OR JSC)

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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